Wymarły gatunek Giant Moa źródło:http://www.labspaces.net/

Od momentu, gdy pojawiły się techniki umożliwiające szybkie sekwencjonowanie DNA, badania opierające się na porównaniu ich sekwencji stały się bardzo popularne i pomocne w rozszyfrowywaniu ewolucji. Informacje uzyskane na podstawie materiału genetycznego obecnie żyjących organizmów daje tylko częściowy obraz procesów zachodzących w przyrodzie już od bardzo dawna.

Wykorzystanie starożytnego DNA pomaga uzupełnić pewne luki, rozwiązując częściowo nasze wątpliwości. Żeby jednak skorzystać z tej ogromnej skarbnicy wiedzy trzeba się często wiele natrudzić. W tym artykule chciałbym przedstawić problemy związane użyciem starożytnego DNA, jak również możliwości i perspektywy płynące z jego wykorzystywania.

Przeprowadzanie badań materiału genetycznego uzyskanego ze znalezisk paleontologicznych, materiałów archeologicznych oraz eksponatów muzealnych stworzyło wiele nowych możliwości dla znacznej liczby dziedzin nauki takich jak biologia, archeologia, historia, kryminalistyka, sądownictwo czy medycyna.

Po pierwsze, praca ze starożytnym DNA, który jest nazywany aDNA, pozwala na udowodnienie lub zweryfikowanie hipotez, które były oparte na niepewnych przesłankach. W minionych latach rozgrywał się nieformalny wyścig mający na celu zsekwencjonowanie materiału genetycznego wymarłych gatunków takich jak np. dront dodo. Dzisiaj naukowcy zaczynają bardziej zastanawiać się nad tym jak geny prehistorycznych organizmów zmieniały się poprzez lata, jak przebiegała ewolucja.

Żeby jednak mówić o aDNA, trzeba wziąć pod uwagę jakość materiału genetycznego otrzymanego z próbek. Tak jak wszystkie czynniki biologiczne podlega on degradacji, czego efektem jest jego fragmentacja. Badania wykazały, że części te składają się zazwyczaj z około 100–500 par zasad. Ustalono również, że wiek próbki nie jest w żaden sposób związany z wielkością fragmentów DNA. Zbliżoną ich wielkość zaobserwowano w próbkach sprzed 4 lat, jak również w izolatach z kości sprzed 13 tysięcy lat. Ważne jest również gdzie znajdowało się DNA zanim dotarli do niego naukowcy. Stosunkowo duże ilości próbek dobrej jakości można otrzymać z materiału zakonserwowanego w niskiej temperaturze, przebywającego w jaskiniach mających swoisty mikroklimat, zalegającego w osadach bagiennych, ze względu na ograniczone działanie mikroorganizmów. Według szacunków ustalono, że maksymalny czas, jaki kwas dezoksyrybonukleinowy może przetrwać w geosferze to, w zależności od warunków, w jakich znajdowała się próbka, od 50 tysięcy do 1 miliona lat.

Najczęściej aDNA jest pobierany z zębów, które są chronione przez szkliwo, które zapobiega zanieczyszczeniu przez materiał genetyczny drobnoustrojów czy cząsteczkami nanoszonymi przez wodę. Również włosy przez to, że są zbudowane z keratyny zapewniającej ochronę, są dobrym źródłem próbek. Poza tym łatwo można usunąć z nich zanieczyszczenia bez szkody dla DNA. Z odchodów także można pozyskać aDNA gospodarza, jak również z niestrawionych resztek pokarmowych. Pozwalają one ustalić sposób życia danego organizmu, a także informują o składzie flory z danego okresu. Próbki do badań pobiera się również z naczyń, przedmiotów wykonanych przez człowieka. Dzięki nim można, np. ocenić przynależność etniczną twórców, poznać rośliny, które uprawiali bądź hodowane przez nich zwierzęta, dowiedzieć się, w jaki sposób konserwowali swoje wyroby.

Pobrany aDNA poddaje się reakcji PCR w celu amplifikacji materiału, dzięki czemu można przeprowadzić analizy bez potrzeby pobierania nowych próbek. Najczęstszą metodą badania jest sekwencjonowanie produktów PCR, lub klonów tych produktów. Wykorzystuje się również markery mikrosatelitarne, ale ich użycie jest ograniczone. Zbudowane są one z krótkich, powtarzających się sekwencji. Liczba powtórzeń danego motywu jest charakterystyczna dla danego markera, a na dodatek może się bardzo różnić między poszczególnymi osobnikami. Dzięki temu każda osoba ma swój jedyny i niepowtarzalny obraz DNA zwany „profilem mikrosatelitarnym”. Umożliwia to np. zbadanie pokrewieństwa pomiędzy postaciami historycznymi. Jednak nie zawsze markery mikrosatelitarne zachowują się do obecnych czasów w stanie nadającym się do analiz.

Do badań kopalnego DNA najczęściej używa się mitochondrialnego lub chloroplastowego kwasu dezoksyrybonukleinowego, ponieważ są one zazwyczaj lepiej zachowane niż materiał jądrowy ze względu na liczne ich kopie w komórce oraz dodatkowe błony otaczające te organelle. Analizie poddaje się fragmenty cytochromu b, podjednostki rRNA, a także oksydazy cytochromowej.

Testy aDNA pozwalają na spojrzenie w przeszłość. Dzięki nim można badać wpływ czynników środowiskowych na pojawianie się i wymieranie różnych gatunków, sprawdzać relacje genetyczne pomiędzy dawno już wymarłymi zwierzętami, a ich żyjącymi obecnie potomkami. Zebranie dużej ilości dobrej jakości DNA umożliwia wykonanie analiz populacyjnych i określenie np. zmienności genetycznej badanych populacji, oszacowanie ich liczebności i poziomu migracji, jak również określenie tempa przemian ewolucyjnych pod wpływem zmian klimatycznych lub zmian wywołanych w środowisku poprzez działalność człowieka. Badania takie umożliwiły ustalenie pokrewieństwa wymarłych już mamutów z obecnie żyjącymi słoniami. Okazało się, że były to słonie indyjskie. W niektórych przypadkach, jak np. u chrząszcza Cicindela dorsalis dorsalis analiza aDNA umożliwiła określenie zasięgu, na jakim występował gatunek, co pomaga w jego późniejszej reintrodukcji. Testy kopalnego DNA pokazują również zmiany częstotliwości występowania kluczowych genów, jaka miała miejsce podczas procesu udomawiania zbóż czy zwierząt.

Co więcej, dzięki prowadzonym badaniom nad aDNA możemy bliżej poznać antyczne kultury np. Etrusków, Indian prekolumbijskich, mieszkańców wysp Andamańskich czy Australijskich Aborygenów poprzez informacje o ich strukturze ludności, migracjach, powstawaniu i ewolucji języków, jak również o zasięgu groźnych chorób zakaźnych jak choćby trąd czy dżuma. Ponadto naukowcy wykorzystują kwas dezoksyrybonukleinowy jako źródło wiedzy na temat początków człowieka. Badania nad mitochondrialnym DNA neandertalczyka wykazały, że nie jest on bezpośrednio związany z mitochondrialnym DNA współczesnego człowieka. Dlatego też pogląd, że pula genowa dawnych ludzi żyjących w Afryce została wzbogacona przez materiał genetyczny archaicznych ludzi żyjących w innych miejscach wydaje się być słuszny. Nie wyklucza to założenia, że neandertalczycy krzyżowali się z hominidami żyjącymi w Europie, przybyłymi z Afryki. Jak do tej pory, nie znaleziono jednak na to dowodu w badaniach molekularnych. Jeśli w przyszłości będzie możliwe zbadanie mitochondrialnego DNA wczesnych hominidów, to wystąpienie w nich mitochondrialnego typu neandertalczyków potwierdzi hipotezę krzyżowania się. Ponadto badania nad aDNA mogą pomóc w odszyfrowaniu miejsca w ewolucji, odkrytego przed kilkoma laty, hobbita z indonezyjskiej wyspy Flores.

Kopalne DNA pozwala także zweryfikować różne hipotezy. Dzięki nim udowodniono, że rzekomo nowy gatunek przeżuwacza występującego w południowo-wschodniej Azji, który opisano na podstawie niewielkich ilości materiałów kostnych zbieranych od początku XX w. (Pseudonovibos spiralis), a pojawiających się głównie na targowiskach, był tak naprawdę fikcją, a znajdywane rogi były tylko spreparowanymi rogami bydła domowego.

Dużym zainteresowaniem cieszą się także analizy odwołujące się do kryminalistyki i archeologii, które umożliwiają ustalenie tożsamości konkretnych osób. Przy ich wykorzystaniu, zidentyfikowano szczątki ostatniego rosyjskiego cara Mikołaja i jego rodziny (1994r.). Metody te są również wykorzystywane w poszukiwaniach szczątków innych postaci historycznych, jak choćby członków francuskiej rodziny królewskiej, włoskich rodów książęcych, czy świętego Łukasza.

Przyszłość paleontologii będzie na pewno jeszcze bardziej związana z aDNA niż jest do tej pory. Badania wykorzystujące ten materiał są trudne do przeprowadzenia, ze względu na łatwe zanieczyszczenie próbek i trudność w zdobyciu materiału do analiz, lecz nie zniechęca to badaczy i dlatego prowadzi się je na coraz większą skalę. Ich wyniki, dostarczą nam nowych informacji o faunie i florze sprzed tysiącleci, dzięki czemu lepiej poznamy procesy ewolucyjne, migracje organizmów między kontynentem amerykańskim i europejskim. Być może uzyskamy również odpowiedzi na pytania dotyczące pojawiania się i zanikania gatunków.

Bibliografia:

1. Ancient DNA, Michael Hofreiter, David Serre, Hendrik N. Poinar, Melanie Kuch & Svante Pääbo, Nature Reviews Genetics 2, 353-359 (May 2001)

2. www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.0030056

3. wapedia.mobi/pl/Antyczne_DNA

4. portalwiedzy.onet.pl/4868,22734,1362326,1,czasopisma.html

Sam projekt planowany był na 15 lat, jednakże znaczny postęp w technikach sekwencjonowania genomu sprawił, iż został ukończony wcześniej. Głównymi założeniami projektu było określenie sekwencji ok 3 miliardów par zasad budujących DNA człowieka, poznanie wszystkich chromosomów i następnie udostępnienie tych danych szerokiemu środowisku naukowemu.

Częścią projektu było również równoległe sekwencjonowanie genomów tzw. organizmów modelowych, takich jak bakterie E. coli., drożdży (Saccharomyces cerevisiae), nicieni (Caenorhabditis elegans), muszek owocowych (Drosophila melanogaster), które pomogło w rozwoju technologii oraz interpretacji wyników sekwencjonowania genomu ludzkiego.

Sponsorami projektu były The Department of Energy’s Human Genome Program oraz the National Institutes of Health’s National Human Genome Research Institute.

Do przyspeiszonego postępu prac przyczyniła się bezpośrednio prywatna firma Celera Genomics (założyczielem był Craig Venter, biolog-przedsiębiorca), która chiała jako pierwsza zsekwencjonowac ludzki genom i tym samym mieć możliwość opatentowania go. Koncern ten wprowadził nową, szybszą technikę sekwencjonowania zwaną shotgun sequencing, polegającą na pocięciu całego DNA na niewielkie fragmenty poddawane analizie. Kombinacje wszystkich par komplementarnych nukleotydów budujących poszczególne odcinki rejestrował komputer co znacznie automatyzowało pracę. Program komputerowy pozwalał na badanie podobieństw między różnymi odcinkami, dzięki czemu możliwe było złożenie odcinków DNA w całość.

W wyniku prac naukowców rządowych i działań konkurencji z Celera Genomics powstałyały artykuły w Nature i Science, ale przede wszystkim wzajemnie się uzupełniające rewolucyjne wyniki badań. Jak złożony był to projekt można zobaczyć na niżej zamieszczonym rysunku (dolna partia).

Human Genome Project

Projekt ten miał na celu opracowanie względnego położenia genów w genomie a także określenie kolejności ułożenia w nim zasad azotowych. Wydany 14 kwietnia 2003 roku dokument potwierdzał zsekwencjonowanie 99% całego genomu ludzkiego z prawie stuprocentową trafnością ( 99,99% ).

Dzięki projektowi HGP oszacowano również całkowitą liczbę genów, jednak jak się okazało, nie było to sprawą trywialną. Na skutek stosowania różnych metod sekwencjonowania, wyniki były skrajnie różne. Przyjęto zatem dolną granicę ze zbioru tych wyników czyli ok. 26 tyś., i taką liczbę genów w genomie oficjalnie poznał świat.

Kolejnym wnioskiem naukowców z HGP było to, że geny nie są jedynymi czynnikami odpowiedzialnymi za wytworzenie się określonych umiejętności i zdolności człowieka, jak również za występowanie chorób .
HGP przyczynił się do odkrycia i rozwinięcia nowoczesnych technik umożliwiających poznawanie genomów, stosowanych z powodzeniem we współczesnych laboratoriach. Najważniejsze z nich zostały omówione poniżej.

• Sekwencjonowanie DNA. Jest to technika laboratoryjna, używana do określenia poznania dokładnej sekwencja zasad (A, C, G i T) w cząsteczce DNA. Sekwencja DNA zawiera kluczowe informacje dla komórki, które pozwalają jej na wytworzenie cząsteczek RNA i białek. Informacja o sekwencji DNA jest istotna dla naukowców zajmujących się badaniem funkcji genów. Co ciekawe, technika sekwencjonowania DNA była jedną z najszybszych i zarazem najmniej kosztownych sposobów na odkrywanie genomów.

• Metoda RFLP. Metoda RFLP czyli Restriction fragment length polymorphism jest techniką pozwalającą na różnicowanie organizmów poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA. Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA pociętych specjalnymi enzymami bakteryjnymi zwanymi restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA powstają w wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te enzymy. RFLP’sy są używane jako markery w mapach genetycznych. Do ich wizualizacji używa się niżej opisanej elektroforezy żelowej.

• Wektor YAC. Sztuczny chromosom drożdżowy czyli Yeast artificial chromosome (YAC) jest wektorem używanym do klonowania dużych fragmentów DNA (od 100 kb i do 3000 kb). To jest sztucznie skonstruowany chromosom i zawiera sekwencje telomerowe, centromer i inne potrzebne do replikacji w komórkach drożdży. Wektory YAC często używane są równocześnie do sekwencjonowania i mapowania genomów. kawałki DNA danego organizmu, o długości nawet do miliona par zasad, ulegają insercji do wektora YAC. Wektor ten wprowadza się do komórki drożdży, gdzie ulega powieleniu. Następnie YAC izoluje się z tej komórki i poddaje  mapowaniu oraz sekwencjonowaniu.

• Wektor BAC. Sztuczny chromosom drożdżowy, bacterial artificial chromosome (BAC), podobnie jak wyżej opisany YAC – jest wektorem. W przeciwnieństwe jednak do niego, służy do klonowania sekwencji DNA w komórkach bakteryjnych (np, E.coli). BACs często używany jest do łączenia przy sekwencjonowaniu DNA. Fragmenty DNA, o wielkości w przedziale od 100,000 do 300,000 par zasad podlegają insercji do wektora BAC, który z kolei jest wprowadzany do komórki bakteryjnej. Stamtąd, po wzroście, podziałach i namnożeniu jest izolowany i sekwencjonowany, podobnie jak YAC.

• Metoda PCR. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji, inaczej Polymerase chain reaction (PCR) jest powszechnie dziś stosowaną techniką laboratoryjną, która służy namnażaniu u powieleniu określonego fragmentu DNA. Metoda PCR polega na wykorzystaniu krótkich sekwencji DNA zwanych starterami, które oznaczają tą cześć genomu, które ma ulec powieleniu. PO wielokrotnych cyklach ogrzewania i oziębiania próbki , następuje powielenie sekwencji docelowej w tempie geometrycznym. Stąd technika ta może przynieść miliardy kopii sekwencji w ciągu zaledwie kilku godzin.

• Elektroforeza. Inną, równie popularną w dzisiejszych czasach, a poznawaną dopiero wczasach Projektu, metodą laboratoryjną jest elektroforeza. Dzięki niej można wyodrębnić DNA, RNA badź cząsteczki białka ze względu na ich wielkość lub ładunek elektryczny. Cząsteczki te, przesuwają się w specjalnym żelu agarozowym pod wpływem przyłożonego napięcia. Generalnie większe cząstki poruszają się wolniej niż te mniejsze, co powoduje powstanie barwnych prążków widocznych w świetle UV.

Dalsze losy projektu. Kolejnym krokiem po 2003 roku było wypełnienie luk, związanych z niedokładnościami wcześniejszego mapowania. Dzięki temu uzyskano bardziej szczegółowy zapis map chromosomowych, postęp tego procesu w skali czasu jest przedstawiony na wykresie:

Chromosomy - kolejność sekwencjonowania

Zapełnianie  luk odbywało się przez  porównywanie poszczególnych sekwencji DNA od osobników reprezentujących resztę populacji w obszarach genomu, które mogły zawierać nieścisłości w uzyskanej sekwencji. Prawdopodobną przyczyną luk okazała się niestabilność segmentów DNA podczas ich kopiowania Występowanie takich błędów oszacowano na 1 na 10000 podjednostek DNA.

Mimo zsekwencjonowania całego genomu ludzkiego, wciąż rodzą się nowe pytania i problemy do rozwiązania: które geny i dlaczego ulegają ekspresji, jakie są funkcje regionów niekodujących w DNA, co koordynuje ekspresją i syntezą białek, jak przewidywać funkcję genów, jak zidentyfikować cechy i choroby wielogenowe oraz wiele, wiele innych pytań. Miejmy nadzieję, że najbliższe dziesięciolecia przyniosą nam odpowiedzi na niektóre z nich.

Bibliografia:

http://genomics.energy.gov/

http://www.genome.gov/10001772